北理工課題組在CRISPR系統元件篩選方面取得重要進展
發(fā)布日期：2024-06-03 供稿：生命學院 攝影：生命學院
編輯：肖雯 審核：周連景 閱讀次數：
近日，北京理工大學霍毅欣教授團隊在CRISPR/Cas9系統功能性sgRNA突變體篩選方面取得重要進展。相關研究成果以“Identification of functional sgRNA mutants lacking canonical secondary structure using high-throughput FACS screening”為題發(fā)表在Cell 子刊《Cell Reports》上（https://doi.org/10.1016/j.celrep.2024.114290）。該工作以北京理工大學為第一通訊單位，博士生梁澤宇為第一作者，霍毅欣教授為通訊作者。
CRISPR/Cas9介導的基因編輯已經成為一種強大的基因改造技術，該系統的主要元件為Cas9蛋白與sgRNA。在sgRNA的引導下，Cas9-sgRNA二元復合體可以識別特定的DNA靶點，并在該位點使DNA序列產生雙鏈斷裂。在對底盤菌株進行代謝工程改造時，往往需要對多個目標靶點進行基因操作，而在CRISPR系統中共表達多個相同的sgRNA易觸發(fā)遺傳不穩(wěn)定性導致序列丟失?，F有的sgRNA篩選系統通常是基于CRISPRi系統設計的，因此無法保證所篩選得到的sgRNA突變體與Cas9蛋白形成復合體后仍具有核酸酶活性 （圖1）。相同sgRNA突變體與Cas9結合后抑制活性與核酸酶活性不一致這一現象有研究提及，但尚未得到系統分析和詳細報道。為了評價現有的sgRNA突變體是否可以用于基因改造，我們系統性地設計了鑒定sgRNA突變體與Cas9蛋白結合后DNA結合活性與核酸酶活性的系統，發(fā)現相同的sgRNA序列兩種活性存在不一致的情況。因此我們需要得到與現有的野生型sgRNA序列差異較大的sgRNA突變體。
圖1 現有sgRNA突變體活性分析
本團隊長期從事CRISPR系統機制探究以及高效基因編輯方法學開發(fā)，2019年以“CRISPR-Cas9-assisted native end-joining editing offers a simple strategy for efficient genetic engineering in Escherichia coli”為題，在領域頂級期刊《Applied Microbiology and Biotechnology》上發(fā)表。該工作報道了一種基于原核體內的微同源末端重組系統的CRISPR/Cas9基因編輯方法，是一種最簡單的基因編輯方法。我們利用該研究的DNA修復方法設計了一種基于生長和/或熒光激活細胞分選（FACS）的高通量sgRNA突變體正向篩選系統。我們首先在篩選標簽中插入一段可以被識別的DNA靶點序列，并引入一段同源序列。當sgRNA突變體與Cas9蛋白形成二元復合體，并在有活性的sgRNA突變體引導下結合至DNA靶點序列形成三元復合體，激活Cas9蛋白核酸酶活性后，在所設計的DNA靶點將會出現雙鏈斷裂，激活原核細胞內的同源修復系統。該同源修復系統利用我們所引入的同源序列進行篩選標簽的修復，使得細胞在篩選條件下出現可被篩選的表型，如可在抗性平板上生長或是通過流式細胞儀進行分選 （圖2）。
圖2 sgRNA突變體篩選體系構建與驗證
之后我們根據sgRNA的結構，分區(qū)進行突變庫構建與篩選，將篩選得到的6個單區(qū)有活性的突變序列進行隨機組合。利用該篩選系統，我們得到了具有突變率超過50%的sgRNA突變體序列，并且這些sgRNA突變體與Cas9蛋白形成復合體后仍能夠在細胞內保持與野生型水平相當的核酸酶活性。通過結構模擬，我們發(fā)現這些sgRNA突變體由于具有高的序列突變率而失去了公認的典型二級結構，這表明Cas9蛋白與sgRNA突變體可以相互適應并進行結構校正。進一步，我們將高通量篩選系統與高通量測序技術相結合。通過高通量測序，最終得到了大量sgRNA突變體序列，并且這些突變體序列均與野生型sgRNA序列有巨大差異 （圖三）。
圖3 sgRNA突變體篩選結果
我們使用這些sgRNA突變體開發(fā)了基于CRISPR/Cas9的多靶點基因編輯工具箱，可以同時實現至多4個位點的基因敲除以及堿基突變。利用該基因編輯工具箱，我們實現了底盤細胞快速工程化改造，得到一系列敲除了不同副途徑的異丁醇生產菌株，并實現異丁醇高產菌株的構建成功將化學品異丁醇的搖瓶產量提高到了13.9g/L。為了拓展該系統的應用范圍，我們利用該工具箱構建菌株突變庫，并與本團隊所報道的生物傳感器BmoR相結合，篩選得到1,3-PDO高產菌株（圖4），并且與野生型相比突變菌株的產量提高了4.5倍。
圖4 sgRNA突變體在代謝工程中的應用
此項工作以北京理工大學為唯一通訊單位，得到了國家重點研發(fā)計劃的支持，也感謝北京理工大學生物與醫(yī)學工程公共實驗中心的支持。
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